基因编辑想用于临床，先过GOTI这关！新技术让曾经逍遥的脱靶无处藏身

或多或少，你一定在这几年里听过 “基因编辑”的大名。这项通过对基因组中特定DNA片段进行敲除、加入、替换等的技术，已成为罕见病的救星。要知道，全球目前有7000多种罕见病和3亿多患者，其中80%都是单基因遗传病。

本年度国际罕见病日才刚过去，由上海科学家主导完成的一项研究适时地为基因编辑技术“降温”——通过构建一种名为GOTI的新型脱靶检测技术，研究人员发现，近年来兴起的单碱基编辑技术有可能导致大量无法预测的脱靶，因而存在严重的安全风险。而此项研究显著提高了基因编辑技术脱靶检测的敏感性，为其安全性评估带来了突破性的新工具。

来源/视觉中国

基因编辑各有缺憾

基因编辑有多火？有着“豪华版”诺奖之称的2015年度生命科学突破奖就颁发给了发明基因编辑工具CRISPR/Cas9的两位科学家。自从2012年被发明以来，CRISPR/Cas9一直以其高效性和特异性备受世人的期待，学术界普遍认为基于CRISPR/Cas9及其衍生工具的临床应用将为人类的健康做出巨大贡献。

“CRISPR具有简易、效率高、成本低、多位点和多种衍生技术等优点。” 中国科学院神经科学研究所进所年龄最小的课题组长杨辉介绍，“但自问世以来，其脱靶风险同样备受关注。若将其用于临床的话，脱靶效应可能会引起包括癌症在内的多种副作用。”

图说：杨辉是中科院神经科学研究所 进所年龄 最小 的课题组长 来源/中国科学院科技摄影联盟（下同）

CRISPR/Cas9技术会导致双链DNA的断裂。在DNA链断裂后，CRISPR/Cas9有两个选择——要么直接添加碱基，破坏原有基因功能，通过沉默基因实现基因敲除；要么利用单链DNA模板，引入新的序列，对基因进行编辑。然而，这两种途径都有“阿喀琉斯之踵”——一些DNA断裂后无法或难以及时修复。

这几年，基因编辑技术的一颗新星冉冉升起。单碱基编辑无需DNA双链的断裂，大大避免了因修复核酸链断端而引入的错误，因而被认为是一种更为精确的基因编辑技术。“由于酶功能的限制，目前单碱基编辑系统可以实现单个碱基胞嘧啶到胸腺嘧啶或反向的编辑，在此同时仍然会导致靶位点产生极少量DNA序列插入或缺失。”杨辉说，“目前，单碱基编辑在疾病研究、动物模型制备、动物和植物育种方面展现了极大的潜力。”

现有局限推动新技术研发

那单碱基基因编辑技术存在脱靶风险吗？“在此之前，科学家曾推出过多种检测脱靶的方案。以前的方法或者依赖于计算机软件预测，或者依靠体外实验的等方法。这些方法都存在一些局限性，不能高灵敏性检测到脱靶突变，尤其是单核苷酸突变。”杨辉表示。可临床应用对潜在风险和副作用的容忍度极低，若要将基因编辑技术投入临床应用，就必须有良好的检测脱靶效应的工具，这促使团队自主研究相关技术。

图说：科研人员在实验中

如果要提升检测脱靶效应的精度，就得彻底颠覆原有的脱靶检测手段。首先，为了实现不借助于脱靶位点预测，这就要求必须找到非常严格的对照组来确定基因突变的位点；同时为了检测不依赖于sgRNA的随机突变，最好使用全基因组测序。为了实现以上目标，杨辉研究组与合作者建立了一种名叫“GOTI”的脱靶检测技术。

研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记。小鼠胚胎发育到14.5天时，将整个小鼠胚胎消化成为单细胞，利用流式细胞分选技术基于红色荧光蛋白的表达，分选出基因编辑细胞和未基因编辑细胞，再进行全基因组测序比较两组差异。这样就避免了单细胞体外扩增带来的噪音问题。而且由于实验组和对照组来自同一枚受精卵，理论上基因背景完全一致，因此直接比对两组细胞的基因组，其中的差异基本就可认为是基因编辑工具造成的。

图说：在小鼠受精卵分裂到二细胞期的时候，编辑一个卵裂球，并使用红色荧光蛋白将其标记 来源/中科院神经所视频截图

单碱基编辑存在脱靶现象

杨辉实验室全体成员与合作单位历时一年半，成功构建了GOTI系统。借助于此系统，团队成员先是检测了经典的CRISPR/Cas9技术。结果发现，设计良好的CRISPR/Cas9并没有明显的脱靶效应，这结束了之前对于CRISPR/Cas9脱靶率的争议。

团队还检测了另一个同样被寄予厚望的CRISPR/Cas9衍生技术：单碱基BE3编辑。这个系统可以精确引入点突变，在之前的研究中从未发现过有明显的脱靶问题，然而在GOTI的检测下发现，BE3存在非常严重的脱靶。这些脱靶大多出现在传统脱靶预测的关注“死角”——难怪之前都没发现。“与对照组相比，BE3单碱基编辑会产生超过20倍的单碱基突变，每个被编辑的胚胎平均产生了283个单碱基突变，且这类突变完全随机无法预测。”杨辉表示，“我们还发现， BE3编辑导致包括原癌基因和抑癌基因在内的等数百个基因突变，这些脱靶性突变可能会引起肿瘤的发生，严重危害健康。”基于此，团队认为，BE3单碱基编辑有很大的隐患，目前不适合作为临床技术。

有望建立行业新标准

“GOTI技术建立了一种在精度、广度和准确性上远超越之前的基因编辑脱靶检测技术，显著提高了基因编辑技术的脱靶检测敏感性和准确性，让脱靶无处藏身。”杨辉总结道。这也是世界首次报道了以BE3为代表的单碱基编辑技术存在之前技术无法检测的脱靶问题，不少国际同行在了解后也都重复出了实验结果。而此前，大家都理所当然认为它们是安全的。

在中科院神经科学研究所所长蒲慕明院士看来，GOTI技术也为热得发烫的基因编辑技术降温，踩了脚刹车。“这一技术有望建立行业新标准。”蒲先生说，“当然，GOTI也有助于我们开发精度更高、安全性更强的新一代基因编辑技术。”

图说：杨辉（中）与课题组成员讨论

该研究由中国科学院神经科学研究所（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室、中国科学院灵长类神经生物学重点实验室杨辉研究组与中国科学院上海营养与健康研究所隶属的计算生物学研究所（中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所）李亦学课题组、斯坦福大学遗传学系以及中国农业科学院深圳农业基因组研究所合作完成。此研究成果今日凌晨在国际顶尖学术期刊《科学》（Science）在线发表。

据介绍，团队在GOTI检测技术基础上，设法改进胞嘧啶单碱基编辑系统，建立一种不会脱靶、也无其它风险的单碱基突变技术。

新民晚报见习记者 郜阳